эксклюзионная хроматография

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ситовая хроматография)

жидкостная хроматография, основанная наразл. способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, который служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент — орг. растворитель) и гель-фильтрацию (элюент — вода).

Ддя Э. х. используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для Э. х. полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а для Э. х. гидрофильных полимеров — гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для Э. х. высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы — декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.

Э. х. эффективно применяют при разработке новых полимеров, технол. процессов их получения, контроле производства и стандартизации полимеров. Э. х. используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

При Э. х. молекулы, имеющие в растворе большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэф. распределения Kd, от которого зависит объем удерживания компонента VR в колонке:

эксклюзионная хроматография

где V0 — объем пространства между частицами сорбента, Vp -объем пор сорбента.

Эффективным размером макромолекулы при Э. х. является ее гидродинамич. радиус R, который вместе с мол. массой полимера М определяет характеристич. вязкость полимераэксклюзионная хроматография. Рис. 2. Универсальную калибровочную зависимость VR от произведенияэксклюзионная хроматография. Рис. 3 (уравнение 2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

эксклюзионная хроматография. Рис. 4

где А и В — константы. Уравнение (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров. Используя уравнение Марка — Ку-на-Хувинка: эксклюзионная хроматография. Рис. 5 гдеэксклюзионная хроматография. Рис. 6 и а — табулированные константы, учитывающие взаимод. полимера с растворителем и степень жесткости макромолекулы, можно перейти от универсальной зависимости (2) к рабочей зависимости (3) для исследуемого образца (рис. 2):

эксклюзионная хроматография. Рис. 7

гдеэксклюзионная хроматография. Рис. 8С2 = B(a+1).

эксклюзионная хроматография. Рис. 9

Рис. 1. Универсальная калибровочная зависимость Бенуа для эксклюзионной хроматографии: эксклюзионная хроматография. Рис. 10 — линейный полистирол; эксклюзионная хроматография. Рис. 11 — разветвленный полистирол; (+) — звездообразный полистирол; эксклюзионная хроматография. Рис. 12- гетеропривитой сополимер полистирола и полиметилметакрилата; эксклюзионная хроматография. Рис. 13 — полиметилметакрилат; эксклюзионная хроматография. Рис. 14- разветвленный полифенилсилоксан; эксклюзионная хроматография. Рис. 15 — полибутадиен.

С др. стороны, получив экспериментально зависимость (2) с использованием полимерных стандартов (не менее 3 образцов), для которых известны М, эксклюзионная хроматография. Рис. 16 и а, а также зависимость (3) для полимера с неизвестными константами, можно найти для негоэксклюзионная хроматография. Рис. 17, а и константы C1 и C2. Можно определять зависимость (3) и непосредственно путем калибровки узкодисперсными (с известными М) и широкодисперсными (с известным ММР) стандартами. Располагая эксклюзионной хроматограммой и калибровочной зависимостью определяют ММР исследуемого полимера.

эксклюзионная хроматография. Рис. 18

Рис. 2. Рабочая калибровочная зависимость для эксклюзионной хроматографии.

В области от V0до VT (объем колонки, доступный для растворителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего Ммин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам V0 и VT мол. массы представляют собой пределы исключения — Ммакс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и Ммин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Эти величины, а также тангенс угла наклона линейной части калибровочной зависимости селективности разделения С2 = Vp/lg(Mмакс/Mмин) и степень ее линейности определяют качество сорбента для Э. х. Благодаря логарифмич. зависимости V от М селективность разделения dV/dM падает с увеличением М, поскольку C2 = (dV/dM)M. Для разделения макромолекул с близкими М требуется сорбент, работающий в узком диапазоне М и обладающий высокой селективностью C2. Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределахэксклюзионная хроматография. Рис. 19 коммерческие сорбенты характеризуютсяэксклюзионная хроматография. Рис. 20. Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне М нужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол.-массовую калибровочную зависимость в диапазоне М = 102,5 — 106,5. Селективность C2 подобного сорбента (или специально подобранной смеси сорбентов) естественно ниже, чем унимодального сорбента, но ее делают максимальной для заданного диапазонаэксклюзионная хроматография. Рис. 21 Макс. селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того,-оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая М находились в пределах ММИНММАКС характерных для данного сорбента. Иначе по краям хроматограммы при VT и V0будут выходить из колонки макромолекулы соотв. с Мэксклюзионная хроматография. Рис. 22ММИНи Мэксклюзионная хроматография. Рис. 23ММАКС, образуя ложные хроматографич. пики.

Механизм Э. х. Макромолекулы в растворе представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и раствором контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из раствора в поры: эксклюзионная хроматография. Рис. 24 гдеэксклюзионная хроматография. Рис. 25- изменение энтальпии макромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с поверхностью сорбента (матрицей геля); эксклюзионная хроматография. Рис. 26- уменьшение энтропии при переходе макромолекулы из раствора в поры; Табс. температура. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когдаэксклюзионная хроматография. Рис. 27, a Kd, зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1.

В критич. условиях, когда при переходе макромолекул из раствора в поры сорбента энергия Гиббса не изменяетсяэксклюзионная хроматография. Рис. 28 происходит полная компенсация потери энтропии макромолекулы благодаря увеличению энтальпии: эксклюзионная хроматография. Рис. 29 т. е. переход макромолекулы из раствора в поры энергетически безразличен. Приэксклюзионная хроматография. Рис. 30>0 и Kd> 1 наблюдается адсорбционная хроматография. В критич. условиях все макромолекулы, независимо от М, имеют Kd= 1 и, не разделяясь, выходят из колонки при VR = VТ В эксклюзионной области приэксклюзионная хроматография. Рис. 31 макромолекулы с большей М сильнее вытесняются из пор, т. к. их энтропия при переходе из раствора в поры уменьшается в большей степени.

На рис. 3 показаны кривые зависимостиэксклюзионная хроматография. Рис. 32 от энергии взаимод.эксклюзионная хроматография. Рис. 33 сегментов макромолекулы (см. макромолекула) с поверхностью сорбента. Эти кривые для макромолекул с разным числом сегментов (N) пересекаются в точке критич. энергииэксклюзионная хроматография. Рис. 34 Кривые левее точкиэксклюзионная хроматография. Рис. 35относятся к режиму Э. х. Отсюда ясно, что Э. х. включает значит. область энергетич. зависимостейэксклюзионная хроматография. Рис. 36 гдеэксклюзионная хроматография. Рис. 37имеет значения отэксклюзионная хроматография. Рис. 38 доэксклюзионная хроматография. Рис. 39 Чем меньшеэксклюзионная хроматография. Рис. 40 тем больше изменениеэксклюзионная хроматография. Рис. 41 при попадании макромолекулы в поры и, следовательно, разделение макромолекулы более селективно.

эксклюзионная хроматография. Рис. 42

Рис. 3. Зависимостьэксклюзионная хроматография. Рис. 43 иэксклюзионная хроматография. Рис. 44 для разных N(N1 N>N2N>N3).

Гетерополимеры (сополимеры, функциональные олигомеры) можно анализировать как с помощью Э. х. (когда у всех компонентовэксклюзионная хроматография. Рис. 45 ), так и в условиях, когда у одного из компонентовэксклюзионная хроматография. Рис. 46 В этих (критических) условиях указанный компонент представляет хроматографич. "невидимку" (его Kd не зависит от М). Последнее позволяет по законам Э. х. анализировать ММР отдельных блоков блок-сополимера, ММР функциональных олигомеров (отдельно для каждого типа функциональности), а вблизи критич. условийэксклюзионная хроматография. Рис. 47 получать с помощью Э. х. ММР олигомеров для каждого типа функциональности.

У макромолекул, несущих электрич. заряд (полиэлектролитов), наблюдаются схожие, но более сильные измененияэксклюзионная хроматография. Рис. 48 в зависимости от pH и ионной силы элюента, Это происходит благодаря увеличению размеров молекул полиэлектролитов при их диссоциации и проявлению кулоновских взаимод. между зарядами на больших расстояниях, чем в случае действия дисперсионных или электростатич. сил. При увеличении pH выше 4 поверхность силикагелей приобретает отрицательный заряд. Взаимод. с ней нейтральной макромолекулы остается эксклюзионным (режим Э. х.), поликатион адсорбируется благодаря ионообменной сорбции, а полианион исключается из пор по законам ионной эксклюзии значительно сильнее, чем при обычной эксклюзии.

Для подавления нежелательных для Э. х. явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют поверхность сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при pH > 4), увеличивают ионную силу растворителя, ослабляя кулоновские взаимод., добавляют орг. растворители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрич. точку у полиамфолитов. С др. стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их растворов, то при Э. х. макромолекулы на краях хроматографич. колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам Э. х., а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда поверхности сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 4), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

эксклюзионная хроматография. Рис. 49

Рис. 4. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в).

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимод. макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами поверхностью сорбента или при электростатич. взаимод. поверхностных силанольных гидроксигрупп с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении Э.х.

Техника Э. х. Для разделения макромолекул в режиме Э. х. используют колонки двух типов: работающие в узкомэксклюзионная хроматография. Рис. 50 = 102 и широком (эксклюзионная хроматография. Рис. 51= 104 — 105 диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается т. обр., чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наиб. степень селективности C2. Можно также составлять колонки для широкого диапазона М из колонок первого типа.

Разные типы полимеров требуют спец. растворителей для Э. х. наиб. универсальный растворитель — ТГФ (для Э. х. полибутадиена, полистирола, полиметакрилата, полиакрилатов). ТГФ имеет низкую вязкость, однако требует очистки от пероксидов. Толуол, хлороформ и метилэтилкетон также широко используют в Э. х. полимеров. Для Э. х. полиолефинов применяют о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол, а для полиакрилонитрила, полиэфиров и полиамидов — м-крезол, фторированные спирты и кислоты.

Калибровку колонок в диапазоне масс 5∙102- 1,5∙107 осуществляют с помощью стандартных узкодисперсных полистиролов. Выпускают также стандарты полиметилметакрилата, полиизопрена, полиэтилена, полиэтиленгликоля и биополимеров (декстран и др.).

Э. х. осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5∙10−8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5∙10−5 %. Обычно прибор работает при комнатной температуре, однако Э. х. полиолефинов требует повышенной температуры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Совр. хроматографы комплектуются автоматич. устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация раствора) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Концентрацию пробы (с) следует уменьшать с ростом М полимера: для полимера с Мэксклюзионная хроматография. Рис. 52104 с = 0,25 % по массе, 3∙104 - 2∙104 с = 0,1%, 4∙105 − 2∙106 с = 0,05%, М>2∙106с = 0,01%.

Применение комбинации рефрактометрич. детектора и детектора многоуглового рассеяния света — фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам.

Э. х. применяют для исследования и выделения полимеров в диапазоне М 102 — 2∙107. Наилучшая селективность достигнута для олигомеров — выделяют олигомергомологи с числом звеньев до 10–15. Особенность Э. х. олигомеров состоит в том, что на хроматограмме выходят пики для каждого из олигомергомологов, присутствующих в олигомере. Поэтому можно определять ММР олигомера без калибровки колонок, если известна М одного или неск. олигомергомологов.

При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от Э. х. синтетич. полимеров и олигомеров, используемой гл. обр. в аналит. целях, гель-фильтрация белков — один из важнейших способов их выделения и очистки. Разрешение белков по М при гель-фильтрации ниже, чем при гель-проникающей хроматографии синтетич. полимеров, т. к. для белков Rэксклюзионная хроматография. Рис. 53М 1/3, а для гибкоцепных полимеров Rэксклюзионная хроматография. Рис. 54М 1/2. Можно повысить чувствительность определения М белков методом гель-фильтрации, если проводить ее в условиях денатурации: в о М растворе гуанидинхлорида (R ~ М 1/2) или в растворе додецилсульфоната Na (R ~ M).

Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, которые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по мол. массе, в качестве сорбента они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять ММР полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.

Лит.: Беленький Б.Г., Виленчик Л. 3., Хроматография полимеров, М., 1978; Нефедов П. П., Лавренко П. Н., Транспортные методы в аналитической химии полимеров, Л., 1979; Энтелис С.Г., Евреинов В. В., Кузаев А. И., Реакционноспособные олигомеры, М., 1985; Yau W.W., Kirkland J., Bly D., Modern size-exclusion liquid chromatog, raphy, N.Y., 1979; Belenkii B.G., Vilenchik L.Z., Modem liquid chromatognphy of macromolecules, Amst., 1983.

Б. Г. Беленький

Источник: Химическая энциклопедия на Gufo.me